使用細(xì)胞轉(zhuǎn)染構(gòu)建穩(wěn)定細(xì)胞系的方法

細(xì)胞系的穩(wěn)定對于其廣泛應(yīng)用具有重要作用。經(jīng)過細(xì)胞轉(zhuǎn)染后的穩(wěn)定細(xì)胞系適用于重組蛋白的生產(chǎn)、基因功能研究以及藥物發(fā)現(xiàn)分析。目的基因在細(xì)胞系中穩(wěn)定表達(dá)，克服了瞬時(shí)表達(dá)轉(zhuǎn)染效率低的問題，產(chǎn)生更多的目的蛋白。
 實(shí)現(xiàn)細(xì)胞系的穩(wěn)定主要有兩種途徑：一種是通過真核載體實(shí)現(xiàn)，該載體在轉(zhuǎn)染細(xì)胞的細(xì)胞核中含有用于附加體維持的元件。另一種是通過將轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒直接整合到靶細(xì)胞基因組中來實(shí)現(xiàn)。由于附加型的穩(wěn)定性比較有限，附加型質(zhì)粒元件通常僅限于某些物種，因此通常使用整合到宿主細(xì)胞染色體中。這種方法所預(yù)期的基因修飾的穩(wěn)定性通常要高得多。
產(chǎn)生穩(wěn)定細(xì)胞系的主要挑戰(zhàn)是低轉(zhuǎn)染效率和整合頻率。使用的轉(zhuǎn)染方法可能直接影響到細(xì)胞的穩(wěn)定的表達(dá)。我們知道脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法中的脂質(zhì)體試劑可用于將 DNA 轉(zhuǎn)移到貼壁細(xì)胞系中。而電轉(zhuǎn)染法主要用于難以轉(zhuǎn)染的懸浮細(xì)胞系中。但是電轉(zhuǎn)染法會(huì)受到一些限制，例如載體生產(chǎn)效率和安全問題，而而且電轉(zhuǎn)染法的細(xì)胞存活率較低
選擇標(biāo)記
   為了選擇穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，選擇標(biāo)記必須與靶蛋白共表達(dá)。標(biāo)記基因可以在同一個(gè)質(zhì)粒載體或第二個(gè)共轉(zhuǎn)染載體上。有多種系統(tǒng)用于選擇轉(zhuǎn)染細(xì)胞，包括對抗生素嘌呤霉素、新霉素、DHFR 和谷氨酰胺合成酶的抗性?；蜣D(zhuǎn)移后，細(xì)胞在含有選擇劑的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。只有那些含有耐藥基因的細(xì)胞才能存活。
產(chǎn)生穩(wěn)定細(xì)胞系的方法
根據(jù)實(shí)驗(yàn)的范圍，有幾個(gè)選項(xiàng)可用于生成穩(wěn)定的細(xì)胞系。耐藥細(xì)胞的混合群體可以直接用于實(shí)驗(yàn)分析，其特點(diǎn)是快速產(chǎn)生結(jié)果，但也有處理不確定和遺傳混合細(xì)胞群體的缺點(diǎn)。還有一種辦法是生成單克隆細(xì)胞系。在這種方法中，需要通過在 96 孔板中鋪板來稀釋抗性細(xì)胞，以便培養(yǎng)為單個(gè)和分離的細(xì)胞。隨后，可以重復(fù)多次克隆單細(xì)胞以獲得全部的克隆純度。總之，根據(jù)目的表達(dá)類型和您要整合的構(gòu)建體，可以有許多不同的方法來生成穩(wěn)定的細(xì)胞系。
穩(wěn)定細(xì)胞系的形成條件
   所選細(xì)胞類型的培養(yǎng)條件（傳代、分裂節(jié)律、數(shù)量等）對于穩(wěn)定細(xì)胞系的產(chǎn)生尤為重要。正常情況下，為了促進(jìn)良好的增殖和細(xì)胞生理，細(xì)胞系應(yīng)在實(shí)驗(yàn)前兩天進(jìn)行傳代。此外，細(xì)胞通道不應(yīng)高于30，因?yàn)榭赡軙?huì)干擾集成效率。
實(shí)驗(yàn)步驟如下：
1.選擇G418濃度
   由于不同細(xì)胞系之間對于 G418反應(yīng)是不同的，許多細(xì)胞系會(huì)隨細(xì)胞傳代次數(shù)而發(fā)生變化。這個(gè)時(shí)候就需要通過實(shí)驗(yàn)確定特定細(xì)胞類型的選擇條件（例如 G418 濃度、鋪板密度）。確定低水平的 G418 濃度，從而減少對細(xì)胞的生長的影響。需要注意的是庫存 G418 的活性濃度也可能因批次而異。因此，我們建議對每個(gè)新批次測試 G418 靈敏度。具體方法如下：

l 在板的每個(gè)孔中預(yù)板 100 μl 培養(yǎng)基。
l 在第一列 (#1) 中加入 100 μl 每孔含有 4000 個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞懸液。
l 輕輕上下移液后，將 100 μl 移至下一列，從而以 1:2 的比例稀釋。對每個(gè)連續(xù)的列重復(fù)此過程。
l 完成后從末列 (#12) 丟棄 100 μl。第一列每孔應(yīng)包含約 2000 個(gè)細(xì)胞，末列平均每孔包含約一個(gè)細(xì)胞。
l 將 100 μl 含有 G418 的培養(yǎng)基 (2.8 mg/ml) 添加到第一行 (A)，使 G418 的終濃度為 1.4 mg/ml。
l 將 G418 添加到以下行中，以逐步降低 G418 的濃度至 0.2 mg/ml。末行 (H) 添加不帶 G418 的培養(yǎng)基。
l 在標(biāo)準(zhǔn)條件下孵育細(xì)胞。
l 通過顯微鏡分析細(xì)胞生長。在某些情況下，細(xì)胞生長也可以通過培養(yǎng)基顏色的變化來觀察。
l 如果您在沒有 G418 的孔中觀察到細(xì)胞生長（10 天后），可以合理地假設(shè)這些細(xì)胞可以從單個(gè)細(xì)胞開始生長。
l 選擇略高于顯示全細(xì)胞死亡的 G418 濃度作為適當(dāng)?shù)?nbsp;G418 濃度進(jìn)行選擇。
2. 細(xì)胞轉(zhuǎn)染
對于轉(zhuǎn)染，可以使用轉(zhuǎn)染試劑盒將含有靶基因和耐藥基因序列的表達(dá)質(zhì)粒直接轉(zhuǎn)染細(xì)胞中。這個(gè)過程中盡量設(shè)置未轉(zhuǎn)染細(xì)胞的陰性對照組以進(jìn)行選擇。可同時(shí)用 GFP 對照質(zhì)粒來檢查實(shí)驗(yàn)的轉(zhuǎn)染效率和整合頻率。
3. 轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞選擇
轉(zhuǎn)染后，讓細(xì)胞生長并在非選擇性條件下表達(dá) G418 抗性蛋白約 24-48 小時(shí)（根據(jù)您的轉(zhuǎn)染系統(tǒng)達(dá)到蛋白表達(dá)峰值）。
直接使用懸浮細(xì)胞或用胰蛋白酶消化貼壁細(xì)胞進(jìn)行分析。在轉(zhuǎn)染后 24-48 小時(shí)通過顯微鏡或蛋白質(zhì)印跡分析您的靶蛋白和陽性對照，分析轉(zhuǎn)染效率。
通過臺(tái)盼藍(lán)染色或其他適當(dāng)?shù)姆椒ㄓ?jì)數(shù)活細(xì)胞。
使用針對細(xì)胞類型預(yù)先測試過的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基和適量的 G418，將細(xì)胞置于 96 孔板中，每孔具有不同的細(xì)胞數(shù)（例如，0.5、1、2、5、10），體積至少為 100 μl每孔。根據(jù)之前確定的細(xì)胞濃度，連續(xù)稀釋。在播種前懸浮細(xì)胞很重要，但要避免通過頻繁移液進(jìn)行苛刻的處理。
一旦出現(xiàn)未轉(zhuǎn)染的對照孔中的細(xì)胞全死亡，就可以分析或進(jìn)一步擴(kuò)增細(xì)胞克隆。
4. 穩(wěn)定細(xì)胞系的分析
一旦獲得抗性細(xì)胞系，應(yīng)該擴(kuò)增細(xì)胞并與陽性和陰性對照比較靶基因。穩(wěn)定細(xì)胞系的分析主要包括蛋白質(zhì)印跡、顯微鏡檢查、ELISA，以及流式細(xì)胞術(shù)等方式來檢測融合蛋白的表達(dá)。
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