細胞劃痕實驗是指將細胞培養(yǎng)在培養(yǎng)皿或平板上，待細胞融合后用槍頭或其他硬物在中 央?yún)^(qū)域畫一條線，這條線內的細胞被機械力去除掉了，然后將細胞繼續(xù)培養(yǎng)，觀察細胞向無 細胞的劃痕區(qū)域遷移的情況，來判斷細胞的遷移能力。其意義在于：價格低廉，操作簡單， 還有很重要的一點在于細胞外圍環(huán)境簡單、單純，容易控制，是腫瘤細胞基本的研究方法。

一、實驗前準備

實驗開始前，將離心管、吸管筒、移液槍、槍頭，直尺等放入無菌超凈工作臺，以紫外 線照射 30min。然后，采用通風機通風 3min。 取出無菌 6 孔板，用黑色記號筆在 6 孔板底部，用直尺比著，均勻的劃橫線，大約每隔 0.5~1cm 一道，橫穿過孔，每孔至少穿過 3 條線。每條黑線的上下緣與劃痕交叉點作為觀察 點，這樣一方面便于觀察另一方面可以一次取多個觀察點，最終可以獲得多個數(shù)據(jù)。 畫好橫線后，在板上分別做好標記。 取下試劑瓶和離心管上的封口膜，且將每個試劑瓶和離心管擰松，方便后續(xù)試驗的操作。

二、細胞準備

取出處于對數(shù)生長期的健康細胞，吸掉原來的培養(yǎng)液，用無菌 PBS 清洗細胞。加入 1ml 胰酶消化液消化細胞，顯微鏡下觀察所有細胞皺縮變圓后加入培養(yǎng)基終止消化。收 集細胞懸液于 15ml 離心管中，800rpm/min 室溫離心 5min。用羅氏 CASY 快速細胞計數(shù)及 活率分析儀進行細胞計數(shù)，棄去上清，加入培養(yǎng)基重懸細胞。，以每孔 1~4×105 細胞的密度 接種到 6 孔培養(yǎng)板上，在含 10%胎牛血清的 DMEM 培養(yǎng)基中培養(yǎng)一天。具體數(shù)量因細胞種 類不同而不同，掌握為過夜能鋪滿。

三、直線劃痕

取出鋪滿六孔板的細胞，用 200ul 槍頭垂直于細胞表面，由孔一端劃向另一端。盡量垂 直于背面的橫線劃痕，槍頭要垂直，不能傾斜。此時可在培養(yǎng)皿的表面清晰看到細胞表面呈 #字形劃痕。

四、PBS 清洗細胞及培養(yǎng)

吸掉舊培養(yǎng)基，用無菌 PBS 洗細胞表面 3 次，去除劃下的細胞，加入含有 1%胎牛血清 的培養(yǎng)基為陰性對照，及含有相應濃度藥物的 1%胎牛血清培養(yǎng)基為藥物刺激組；每組 2 個 復孔。 輕輕搖動六孔板，使藥物與細胞培養(yǎng)液充分混合，放入 37 度，5%C02 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

五、結果觀察

分別取劃痕 0 小時、24hr、48hr 后觀察不同處理組的痕道寬度。 結果可見：細胞劃痕后 48h 觀察到對照組細胞劃痕寬度恢復約 90％，而藥物抑制組恢 復約 60％。 表明加入藥物后，由于藥物的作用，使細胞遷移受到抑制，而未加入藥物的細胞保持原 有的遷移能力，在 48h 后通過遷移將劃痕掩蓋。

六、注意事項

1、細胞密度 注意細胞生長狀況，選擇適當?shù)募毎臃N密度，對不同的細胞要觀察其貼壁率等，保證 培養(yǎng)終止時密度適當。

2、沖洗細胞緩慢輕柔 在用 PBS 緩沖液沖洗時，注意貼壁緩慢加入，以免沖散單層貼壁細胞，影響實驗拍照 結果。

3、低濃度或無血清培養(yǎng) 劃痕 PBS 沖洗后應該加入無血清培養(yǎng)基或者低濃度血清培養(yǎng)基，以排除細胞本身增殖 對實驗的影響。

蘇州阿爾法生物實驗器材有限公司十三年來專注于生物實驗室儀器設備B2B專業(yè)供應，主要產品包括生物反應器、發(fā)酵罐、細胞生物反應器、微生物發(fā)酵罐、搖床等細胞培養(yǎng)及制藥相關實驗室儀器。同時提供細胞培養(yǎng)瓶、滾瓶、培養(yǎng)板、移液器吸頭、離心管、PCR管等實驗室耗材。