外泌體通常被認為是細胞間信號分子，包含許多蛋白質(zhì)、核酸、細胞因子、轉(zhuǎn)錄因子和其他細胞來源的顆粒。外泌體不僅可以向局部環(huán)境傳遞信息，還可以向距離很遠的細胞和組織傳遞信息。這可能作為一般信號和通信通路，但也可能參與致癌基因擴散和惡性腫瘤進一步惡化。迄今為止，已證實外泌體存在于體液中，例如羊水、血清、母乳、附睪液、唾液、尿液、腹水和胸腔積液、支氣管肺泡灌洗液、滑液和體外細胞培養(yǎng)上清液中 。細胞排出的外泌體也可作為去除不必要的蛋白質(zhì)和核酸的一種方式，例如，在細胞成熟（網(wǎng)織紅細胞）或排泄系統(tǒng)（腎的內(nèi)臟和小管 ）期間的外泌體。

     為了正確使用外泌體作為 DDS，我們必須考慮外泌體的成分和它們的形成途徑。然后，還應描述外泌體親和力和細胞攝取的特征。外泌體載體表現(xiàn)出不同的目的和功能，這要歸功于外泌體作為基本的轉(zhuǎn)運體本身就具有出色的特性。這可以用于細胞靶向，也可以作為藥物的額外增強。迄今為止，ExoCarta 在外泌體中發(fā)現(xiàn)了大約 10,000 種蛋白質(zhì)、3500 種 mRNA 和超過 1100 種不同的脂質(zhì)。 對于系統(tǒng)審查，出現(xiàn)了許多很棒的數(shù)據(jù)庫，例如Vesiclepedia和 ExoCarta，其中描述了外泌體分離程序和來源以及已識別的載體.
     外泌體蛋白質(zhì)特征是:膜結(jié)合四跨膜蛋白（CD9、CD63、 CD81 和 CD82），以及常規(guī)用于分離的 EpCAM 和 Rab5 。其他蛋白質(zhì)是受體（CD46 和 CD55）、熱休克蛋白（HSP ；Hsc70、Hsp70 和 Hsp90）、參與外泌體形成的蛋白質(zhì)（ Alix、TSG101）和負責融合和轉(zhuǎn)運的膜蛋白（GTP 酶、膜聯(lián)蛋白和 flotillin；ATP7A、ATP7B、MRP2  、SLC1A4 、SLC16A1 和 CLIC1)等。使用 ELISA法檢測這些標記蛋白可以用于確認外泌體的存在。
     也有相關(guān)研究稱外泌體含有其他顆粒，如膽固醇（B 淋巴細胞來源）、鞘脂、磷酸甘油酯和神經(jīng)酰胺等。外泌體還運輸形態(tài)發(fā)生素（Hedgehog、 Wingless 和 Wingless-like），參與黑腹果蠅所描述的組織模式發(fā)育。
         核酸是在外泌體中發(fā)現(xiàn)的另一組主要顆粒，即 DNA 和 RNA，它們可以在細胞中發(fā)揮功能作用。在源自小鼠和人類肥大細胞的外泌體中發(fā)現(xiàn)了約 1300 種 mRNA、121 種 miRNA 和 >100 種小 RNA，但未檢測到 DNA 和 rRNA 。 在外泌體中發(fā)現(xiàn)的其他 miRNA 是 lin-4 和 let-7 ，以及母乳中的 miR-181a 和 miR-155。

一些外泌體 miRNA 可用作診斷中的生物標志物（ 表 2）。

小鼠外泌體對人類細胞的刺激可以導致人類細胞中小鼠蛋白質(zhì)的合成。此外，外泌體和受體細胞的 mRNA 譜不同，表明 mRNA 被主動分選為 MVB。
外泌體的分離方法
目前，有許多可用的外泌體分離方法（ 表 1）。比較傳統(tǒng)的外泌體分離方法是超速離心，許多人將其視為金標準。其他技術(shù)主要基于大小排阻或抗體介導的標記外泌體分離。每種分離方法在純度、數(shù)量、效率和通量方面都不同。超速離心法分離法 的缺點是外泌體結(jié)構(gòu)容易發(fā)生改變，造成外泌體的結(jié)構(gòu)不一致性甚至會導致外泌體受損。
表 1. 外泌體分離方法。

1.超速離心法：
   超速離心基于顆粒的大?。ㄖ亓浚┘捌湓陔x心力（100,000–110,000× g）下的離心沉降。至于去除的細胞碎片和不需要的顆粒可以通過稱為差速離心的幾步慢速離心來獲得。外泌體的純化可以采用蔗糖梯度密度離心純化法：即：在蔗糖梯度 (1.13–1.19 g/mL) 或緩沖液中進行，以實現(xiàn)更高的富集、產(chǎn)量和純度增加。 
2.超濾法：
   超濾法使用的是微孔過濾器；因此，較大的顆粒將從濾液中排除。它可以與離心結(jié)合使用，通過初步去除細胞碎片等大顆粒來加速外泌體的純化。不過使用此方法需要防止孔隙堵，不適合大規(guī)模的樣本處理。
3.尺寸排阻層析法
    尺寸排阻層析法也被稱為凝膠過濾層析法，這種方法是基于凝膠孔的大小和外泌體的大小，大于凝膠孔徑的顆粒被洗脫；反之，小于凝膠孔徑的顆粒將被抑制。凝膠過濾層析 分離法總體上能獲得較高的純度和產(chǎn)量。建議與超濾相結(jié)合，這種方法可提供更少的蛋白質(zhì)污染和更高的外泌體回收率。 凝膠過濾層析分離法的缺點是凝膠的成本過高。
4.沉淀分離方法：
   基于聚合物的沉淀分離方法是利用超親水聚合物來增強小尺寸顆粒（如外泌體）的沉淀。聚乙二醇的常用濃度在 8% 到 15% 之間變化。使用這種方法，將含有外泌體的溶液與聚合物一起孵育過夜，并在約 10,000× g下進一步離心。
5.免疫學分離方法
   免疫學分離法是利用受位于外泌體膜中的選定蛋白質(zhì)標記物影響的抗體對外泌體進行標記。這些標記的外泌體可以進一步輕松處理和純化，例如，使用微芯片或磁珠。磁分離后，外泌體被純化，磁珠被溶解和去除。通過這種簡單快速的方法，就可以獲得較高純度提取物，但不會分離出缺乏磁性標記抗體識別的表面標記的外泌體，這可能導致外泌體池表現(xiàn)效果 不佳。這種方法雖然既省時又直接，輸出純度較高，但也需要較為昂貴的試劑。
6.親和層析分離法
在親和層析分離法方面，主要使用凝集素和合成 Vn (venceremin) 肽。凝集素將結(jié)合存在于外泌體表面的糖基化蛋白質(zhì)，從而使 外泌體沉淀。Vn 肽分離技術(shù)基于其對含有 HSP 的細胞外顆粒的高親和力。然而，這種方法比較容易使提取物被膜表面上含有上述標記物的細胞和其他顆粒污染。
7.微流控分離法
  微流控分離法主要是在微芯片上進行的，這里我們需要提及的是，微流控分離法法可用于外泌體分離（免疫結(jié)合和磁結(jié)合、過濾），效率相對較高（約 90%）。
8.FFF分離法
  FFF 目前是一種很少使用但前景不錯的一種外泌體分離方法。分離由橫流力驅(qū)動，并基于顆粒的分子量或流體動力學直徑。它包括高純度、高效率和短時間處理，但迄今為止，F(xiàn)FF 在外泌體分離中的使用案例較少 ，還有待進一步開發(fā) 。
9.聲學流體分離
   聲學流體分離技術(shù)利用聲場根據(jù)粒子的大小、密度和可壓縮性來分離粒子。生物樣品在此過程中不會受到損壞，并且分離的本身是非接觸式、高效的和無標記的。
10.納米粒徑分析法
   確定性橫向位移依賴于顆粒流動路徑的變化，而顆粒流動路徑取決于顆粒尺寸。這種方法雖然比較簡單，但是需要使用掃描電鏡技術(shù)、動態(tài)光散射技術(shù)、納米粒子跟蹤分析技術(shù)、單粒子干涉反射成像傳感器（SP-IRIS）技術(shù)等。對于外泌體大小、形態(tài)、外泌體的 濃度、zeta電位等分析也可以使用Nanocoulter粒度分析儀。


11.介電泳分離法：
介電泳分離法主要利用不同大小的粒子在不均勻電場中的位置差異。外泌體被吸引到高電區(qū)域，而較大的顆粒將位于低電區(qū)域。該方法速度快，適合用于高通量篩選，但缺點是需要加熱。
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