CHO細(xì)胞外泌體的分離和表征

CHO 細(xì)胞是一種廣泛用于生物制藥蛋白質(zhì)生產(chǎn)的宿主。 CHO 細(xì)胞中分離外泌體主要采用聚合物的沉淀 (PBP) 技術(shù)從分批培養(yǎng)中分離和富集細(xì)胞外泌體囊泡。分離后的外泌體可以通過多種方法來檢測(cè)和表征分離的囊泡，這些分析包括動(dòng)態(tài)光散射 (DLS) 和 Zeta 電位測(cè)量、電子顯微鏡 (EM) 和外泌體標(biāo)記物分析、RNA 和脂質(zhì)分析等。
一、細(xì)胞培養(yǎng)
1.培養(yǎng)基與細(xì)胞
細(xì)胞可使用CHO系中的CHO-S 細(xì)胞。
培養(yǎng)基使用 CD-CHO 培養(yǎng)基（ThermoFisher）。在培養(yǎng)基中添加 8 mM L-谷氨酰胺利于CHO細(xì)胞生長(zhǎng)。
2. 培養(yǎng)：
培養(yǎng)物通常在錐形瓶中以 20 ml 分批培養(yǎng)模式在二氧化碳振蕩培養(yǎng)箱中 37 °C 下以 120 rpm 搖動(dòng)培養(yǎng)。細(xì)胞每 3-5 天傳代一次，接種率為 0.2 × 10 ⁶ 個(gè)活細(xì)胞/ml。對(duì)于制備外來體制劑的分批培養(yǎng)，將細(xì)胞以 0.2 × 10 ⁶ 個(gè)活細(xì)胞/ml 接種在 20 ml 培養(yǎng)物中，然后在培養(yǎng)的第 3 天和第 5 天收獲上清液。
3. 收獲：
收獲后的樣本，細(xì)胞沉淀物和 5 個(gè) 3 × 10 ⁶細(xì)胞沉淀物樣品進(jìn)行等分，用于細(xì)胞脂質(zhì)和蛋白質(zhì)分析。通過高速離心機(jī)以 2,000×g 離心 5 分鐘沉淀細(xì)胞，并儲(chǔ)存在 - 80 °C超低溫冰箱中。所有剩余的培養(yǎng)物上清液都用于分離外泌體，如下所述。
二、通過聚合物沉淀法 (PBP) 制備外泌體
根據(jù)制造商的指南，使用 TEI 總外泌體分離試劑盒（Invitrogen）從培養(yǎng)基中分離外泌體。將細(xì)胞培養(yǎng)基以 2000× g離心30 分鐘以去除細(xì)胞和任何碎片；隨后將上清液小心移至離心管管中，加入 0.5 倍體積的 TEI 試劑，充分混合并在 4°C 下孵育過夜。然后將樣品在 4°C 下以 10,000× g離心1 小時(shí)，然后在棄去上清液后，將富含外泌體的顆粒重新懸浮在 75 μl PBS 緩沖液中。然后將樣品儲(chǔ)存在 - 20°C 下，直到需要進(jìn)行后續(xù)分析。
外泌體的表征分析
1.動(dòng)態(tài)光散射
使用 Anton-Paar Lightsizer 500 粒子分析儀測(cè)定外泌體制劑中的粒度分布。動(dòng)態(tài)光散射測(cè)量由于溶液中粒子的布朗運(yùn)動(dòng)引起的散射光強(qiáng)度的動(dòng)態(tài)波動(dòng)，（685 nm 的激光，檢測(cè)角度為 15、90、175 度）；較小的粒子比較大的粒子移動(dòng)得更快。
確定顆粒大小時(shí)，通常使用三種分布類型：
(1) 數(shù)量分布，報(bào)告不同大小“箱"中的顆粒數(shù)量；
(2) 體積分布報(bào)告不同尺寸類別的顆?？傮w積；
(3) 強(qiáng)度分布，報(bào)告不同大小顆粒散射的光。
也可以使用高分辨率納米粒徑分析儀 Nanocoulter Ⅰ來分析樣品中每種大小的囊泡的實(shí)際數(shù)量、濃度及粒子動(dòng)態(tài)、Zeta 電位等。
為了進(jìn)行分析，將先前儲(chǔ)存在 - 20°C 的 75 μl 等分試樣的外泌體制劑用 925 μl PBS 稀釋（得到 1 ml）并轉(zhuǎn)移到一次性比色皿中用于 DLS 測(cè)量。每個(gè)樣品在 DLS 和 Zeta 電位實(shí)驗(yàn)中測(cè)量五次，如下所述。
2. Zeta 電位
通過電泳光散射 (ELS) 測(cè)量的 Zeta 電位測(cè)量粒子在電泳場(chǎng)中的速度。Zeta 電位是膠體分散體穩(wěn)定性的指標(biāo)（絕對(duì)值）和囊泡表面電荷的量度（+ 或 - 符號(hào)）。
3.電子顯微鏡分析
對(duì)于電子顯微鏡分析，外泌體制劑在 PBS 緩沖液中按 1:10 稀釋，隨后在等體積的 4% (w/v) 多聚甲醛和 1% (v/v) 戊二醛中固定 5 分鐘。然后將樣品置于 formvar-carbon 涂層的 600 目銅網(wǎng)格上，并在室溫下干燥 5 分鐘。隨后將樣品在乙酸雙氧鈾溶液（2% 水溶液）中進(jìn)行對(duì)比，并在電子顯微鏡（Jeol1230 TEM）下觀察，加速電壓為 80 kV，并連接到數(shù)碼相機(jī)進(jìn)行觀察 .

三、Bradford 分析法測(cè)定樣品中的蛋白質(zhì)含量
為了量化培養(yǎng)第 3 天和第 5 天的 CHO 細(xì)胞沉淀物和外來體制劑中的蛋白質(zhì)含量，對(duì)細(xì)胞裂解物以及外來體裂解物和 75 μl 等分試樣（每份均來自 1 ml 培養(yǎng)物）進(jìn)行 Bradford 測(cè)定非裂解外泌體 。通過向細(xì)胞或外泌體制劑中添加先前描述的裂解緩沖液來制備裂解物。
1.SDS-PAGE 和蛋白質(zhì)印跡
對(duì)裂解和未裂解的外泌體制劑以及分批培養(yǎng)第 3 天和第 5 天的細(xì)胞裂解物進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡。所有樣品均在還原（含有 β-巰基乙醇）或非還原 Laemmli 樣品緩沖液中制備，在 95 °C 下煮沸 5 分鐘，隨后如前所述通過 12% SDS-PAGE 分離。每個(gè)蛋白質(zhì)樣品上樣約 5 g。以下一抗用于已知外泌體標(biāo)記物的蛋白質(zhì)印跡；抗 CD63（Santa Cruz，sc-5275）、抗 CD81（Santa Cruz，sc-166029 和 sc-23962）和抗 TSG101（Santa Cruz，sc-136111）。
3. RNA分離和分析
從收獲的第 3 天和第 5 天的 3 個(gè)外泌體樣本中提取總 RNA。根據(jù)制造商的說明，使用總外泌體 RNA (TER) 和蛋白質(zhì)分離試劑盒（Invitrogen）提取 RNA。從源自 1 ml 培養(yǎng)物的每個(gè)外泌體樣品中洗脫出 30-35 μl RNA。然后使用 NanoDrop ND-1000 分光光度計(jì)估計(jì)回收的 RNA 總量。
4.脂質(zhì)分析
從 (a) 總細(xì)胞沉淀中提取脂質(zhì)（1 × 10 ⁶個(gè)活細(xì)胞，在第 3 天收獲時(shí)含有 298.9 g 蛋白質(zhì)，在第 5 天收獲時(shí)含有 477.2 g 蛋白質(zhì)），儲(chǔ)存在 - 80 °C，和（ b) 從 7 × 1 ml 培養(yǎng)物中分離出的合并外泌體（即我們?cè)诿總€(gè)時(shí)間點(diǎn)從 1 ml 培養(yǎng)物中分離出 7 × 75 μl 等分試樣，然后將它們合并在一起）. 然后通過向細(xì)胞/外泌體制劑中加入氯仿：甲醇 (2:1) 溶液 (3 ml)，從這些樣品中提取脂質(zhì)進(jìn)行分析。
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