用肉眼或光學顯微鏡檢測支原體比較困難，所以支原體檢測一般會通過PCR 的檢測、DNA 染色、熒光標記、瓊脂平板接種等 方法來實現(xiàn)。在支原體檢測之前，細胞應連續(xù)培養(yǎng)至少兩周，以便有時間讓低水平的污染物生長。對于測試，在取樣前至少兩三天內不應更換培養(yǎng)基。

一、培養(yǎng)法

在瓊脂平板/肉湯上培養(yǎng)被認為是檢測支原體的“金標準"。在這種方法中，將細胞培養(yǎng)物的上清液添加到液體或半固體培養(yǎng)基（含有支原體生長所必需的營養(yǎng)物質）中。受感染的細胞培養(yǎng)物會在液體肉湯和瓊脂平板上生長。瓊脂平板上很容易看到支原體菌落。這種方法能夠檢測大多數(shù)支原體種類，除了少數(shù)種類。

二、PCR法

另一種用于檢測支原體的方法是使用 PCR。在該技術中，使用了對各種常見感染性支原體的 16s RNA 基因特異的 PCR 引物。范圍廣泛的引物涵蓋了幾乎所有的感染性支原體。該過程中使用的引物是物種/基因特異性或通用的。這種方法快速、高效、可靠且具有成本效益。

基于傳感器細胞的方法使用專門的細胞來檢測培養(yǎng)物中支原體的存在。一旦這些細胞檢測到支原體，它們就會引發(fā)一系列化學反應，從而引起明顯的顏色變化。該方法靈敏度高但特異性低(Degeling, 2012)。

三、使用支原體檢測試劑盒

生物發(fā)光檢測試劑盒可從不同的生物技術公司獲得，這些試劑盒是基于酶的支原體檢測試劑盒。這些試劑盒可檢測不是由真核細胞合成的支原體酶。首先，試劑盒成分會破壞支原體，然后使用特定的酶來觸發(fā)產(chǎn)生發(fā)光的細胞機制。然后可以通過光度計檢測到這一點。

可以在受感染的培養(yǎng)基中加入非特異性 DNA 染料來檢測支原體。當在熒光顯微鏡下觀察時，支原體 DNA 以小簇的形式出現(xiàn)，與細胞 DNA 分開。

四、熒光染色法

熒光 DNA 染色是另一種 DNA 染色方法。此方法使用 DAPI 和 Hoechst 33258 等 DNA 染料對所有 DNA 進行染色。在此過程中需要一些專業(yè)知識，因為結果解釋可能很困難。支原體的低密度、其他細菌的污染或這些細菌產(chǎn)生的細胞外熒光信號會阻礙正確的結果解釋。此外，來自核區(qū)域的信號使支原體的檢測變得困難。

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預防支原體污染的方法

1. 加強實驗室操作管理：嚴格控制實驗室操作，加強實驗服的消毒除菌，要求實驗室工作人員戴口罩和手套，保證實驗室的清潔。

比如通過培訓合格的細胞培養(yǎng)人員，從而消除不規(guī)范操作所引起的支原體污染。如果可能，應提供一個單獨的實驗室用于細胞培養(yǎng)和細胞系的維護。為實驗室設施提供這樣的環(huán)境不僅可以減少支原體，還可以避免其他細菌和真菌污染。

另外要做好細胞室的消毒工作，熟練掌握季銨酸鹽消毒液、醇類消毒液、殺孢子劑等消毒劑的使用方法，同時做好個人防護工作，比如：工作時戴上手套，使用后丟棄。確保定期更換手套和口罩，而不是將它們放在實驗室外套的口袋里。

為實驗室配備單獨的鞋子，以避免帶入細菌和環(huán)境污染物。

還有需要注意的是人類口腔中其實也含有多種支原體，當你說話、大笑、打噴嚏或咳嗽時，支原體也可能會進入細胞培養(yǎng)物。所以細胞室內盡量避免在實驗室內打噴嚏或咳嗽或大聲說話。

2. 更換污染的細胞源：更換污染的細胞源，以確保細胞的正常生長和發(fā)育。

被污染的細胞源是支原體污染擴散的主要途徑之一。所以，已被污染的細胞可以直接丟棄，避免造成交叉污染，除非價格較高或典型樣品。

3. 采用有效的消毒措施：采用有效的消毒措施，如紫外線消毒、甲醛消毒等，有效殺滅細胞污染源。

    4.細胞傳代培養(yǎng)前要做好支原體污染檢查

A.細胞使用前也需要檢查細胞系儲備液是否存在支原體污染。

B.確保用于傳代培養(yǎng)的血清中不存在污染。避免使用過期產(chǎn)品或存放時間較長的試劑。

C.盡可能使用新鮮的培養(yǎng)基和密封緊密的培養(yǎng)基。

D.使用一次性移液器以避免交叉污染。

E.確保在工作之前和期間將所有必需的設備和試劑放在層流氣流中。

F.在使用細胞系進行檢測或分析之前，對支原體污染進行常規(guī)檢查。

G.可以選擇使用 0.1 微米過濾器進行過濾除菌，可以減少支原體污染的發(fā)生。

H.避免細胞培養(yǎng)物長時間暴露在空氣中，并確保在將它們放入培養(yǎng)箱之前擰緊瓶蓋。以防止氣溶膠污染。盡量以小瓶的形式對冷凍保存的細胞系進行備份，即使冷凍保存細胞的活力隨著每次傳代培養(yǎng)而降低。

5.實驗室設備與支原體污染

定期熏蒸層流和實驗室設施也可以有效降低支原體污染的發(fā)生概率。

用于細胞培養(yǎng)的CO 2培養(yǎng)箱不得過度擁擠（填充不超過其容量的 60%），否則會導致支原體從一種細胞系感染到另一種細胞系。

多個細胞系不應儲存在一個培養(yǎng)箱中，因為它會增加交叉污染的風險。

應定期清潔 CO2 培養(yǎng)箱，避免任何形式的潮濕。為保持濕度而提供的蒸餾水應定期更換，因為支原體、細菌和真菌可以駐留在這些容器中。

水浴鍋、液氮容器、試劑瓶等感染源必須定期清洗，定期檢查有無污染。

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支原體污染的處理辦法：

那么你發(fā)現(xiàn)了支原體污染，你接下來要做什么？直接的方法是丟棄受感染的細胞培養(yǎng)瓶。在樣本不可替代或非常昂貴的情況下，只能采取一些方法進行支原體清除來彌補損失。

支原體清除是一個非常耗時的過程，并且會增加對其他健康細胞系造成二次污染的風險。根據(jù)感染的嚴重程度，支原體清除可能需要幾周到幾個月的時間。 支必清是一種使用廣泛支原體清除試劑，可以清除培養(yǎng)基中存在的大部分支原體。此外，BM Cyclin、氟喹諾酮環(huán)丙沙星、ciprobay、zagam、baytril、四環(huán)素等藥物也可用于從受感染培養(yǎng)物中去除支原體。

支必清可以有效去除大部分支原體污染，使用方便，對廣泛的支原體有效。雖然這些方法不能保證去除支原體，但可以去除大部分支原體污染?？偟膩碚f，在進行支原體清除時，是會影響到細胞的生長和細胞活力的。

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