大多數(shù)細(xì)胞系和原代細(xì)胞培養(yǎng)物生長為單一厚度的細(xì)胞層（單層）或附著在玻璃或經(jīng)過特殊處理的塑料基質(zhì)上的薄片。為了保持培養(yǎng)物的健康和積極生長，通常需要定期對(duì)它們進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

   常見的傳代培養(yǎng)方法涉及通過使用蛋白水解酶（如胰蛋白酶或膠原酶）破壞細(xì)胞間和細(xì)胞與基質(zhì)的連接。在細(xì)胞解離成主要由單細(xì)胞組成的懸浮液后，將它們稀釋并轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)容器中。在那里它們可以重新附著并開始生長和分裂，經(jīng)過一段時(shí)間的孵化后再次接近匯合。此時(shí)，它們可以再次進(jìn)行傳代培養(yǎng)或用于實(shí)驗(yàn)。

   以下指南描述了典型單層細(xì)胞培養(yǎng)的常規(guī)傳代和維護(hù)所涉及的基本原則。為了獲得一致的結(jié)果，保持良好的記錄很重要。記錄應(yīng)包括細(xì)胞傳代日期和傳代次數(shù)。

細(xì)胞周期性檢查

定期仔細(xì)檢查培養(yǎng)物以確定其狀態(tài)和健康狀況是一種很好的做法。用肉眼檢查培養(yǎng)容器中的內(nèi)容物，尋找微生物污染的宏觀證據(jù)，例如意外的 pH 值變化或培養(yǎng)基中的濁度和顆粒。還要尋找通過顯微鏡可能不容易看到的小真菌菌落。這些菌落可能漂浮在介質(zhì)-空氣界面上，尤其是在容器邊緣周圍。

其次，使用倒置顯微鏡檢查一般細(xì)胞形態(tài)和生長模式。仔細(xì)尋找微生物污染的任何微觀證據(jù)。在某些細(xì)胞系中，漂浮在培養(yǎng)基中的細(xì)胞是細(xì)胞死亡的標(biāo)志。然而，許多細(xì)胞在有絲分裂期間聚集，形成非常折射（明亮）的球體，如果培養(yǎng)物受到物理干擾，這些球體可能會(huì)自由漂浮。死細(xì)胞通常會(huì)聚集并分離，但通常不會(huì)折射。

除了這些日常檢查外，定期培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行真菌和細(xì)菌檢測，并檢測支原體污染情況。有幾種方法可用于檢查這些污染物。有關(guān)支原體檢測試劑盒和細(xì)胞培養(yǎng)試劑的信息，請參閱蘇州阿爾法生物實(shí)驗(yàn)器材網(wǎng)站。

準(zhǔn)備培養(yǎng)基

準(zhǔn)備推薦用于細(xì)胞系的新鮮培養(yǎng)基，并適當(dāng)標(biāo)記培養(yǎng)容器。一定要添加補(bǔ)充劑并平衡 pH 值。在一個(gè) 75 cm 2 的燒瓶中，使用大約 12 至 15 mL 的培養(yǎng)基。相應(yīng)地調(diào)整其他培養(yǎng)容器的體積。

收獲細(xì)胞

大多數(shù)細(xì)胞培養(yǎng)物如果在達(dá)到匯合之前進(jìn)行傳代培養(yǎng)（仍然有一些可用的生長空間），則生長最好。這將有助于使細(xì)胞保持在活躍的對(duì)數(shù)生長期。應(yīng)始終在為每個(gè)細(xì)胞系維護(hù)的記錄表上注明任何異常觀察結(jié)果。收集步驟旨在將細(xì)胞從其基質(zhì)中去除，并盡可能溫和地破壞細(xì)胞間的鍵合。對(duì)于大多數(shù)細(xì)胞培養(yǎng)，這需要在緩沖鹽水溶液中使用化學(xué)或酶解離劑。

  胰蛋白酶 是常見的解離劑，通常以 0.05% 至 0.25% 的濃度使用。適宜工作濃度通常是通過使用min濃度的胰蛋白酶來確定的，該胰蛋白酶會(huì)在相對(duì)較短的時(shí)間內(nèi)（10 到 15 分鐘的孵育）從基質(zhì)中去除細(xì)胞并產(chǎn)生單細(xì)胞懸浮液。有些細(xì)胞比其他細(xì)胞更難分離，因此胰蛋白酶溶液經(jīng)常添加酶（如膠原酶）或螯合劑（如 EDTA）以改善結(jié)果。

    在含有哺乳動(dòng)物來源血清的培養(yǎng)基中生長的細(xì)胞需要洗滌以去除血清，因?yàn)橐鹊鞍酌笗?huì)受到其存在的抑制。殘留血清通常是胰蛋白酶溶液無法將細(xì)胞與底物和彼此分離的原因。有多種緩沖鹽溶液可用。通常是基于Hanks 緩沖鹽水溶液、Earle 緩沖鹽溶液或 Dulbecco 磷酸鹽緩沖鹽溶液的改進(jìn)。如果要將這些制劑用于解離細(xì)胞，通常會(huì)將這些制劑修改為不含鈣和鎂 (CMF-PBS)，因?yàn)檫@兩種離子在細(xì)胞與細(xì)胞和細(xì)胞與基質(zhì)的附著中起著重要作用。

收獲單層細(xì)胞的步驟 

1.取出并丟棄培養(yǎng)基。

2.用 5 mL 的解離溶液沖洗細(xì)胞片并取出。（本協(xié)議中使用的量適用于 75 cm 2燒瓶；對(duì)于其他容器中的培養(yǎng)物，按比例減少或增加量。）如果解離溶液含有胰蛋白酶，則去除所有痕量的血清非常重要，其中含有胰蛋白酶抑制劑。

3.添加 2 至 3 mL 的解離溶液。每 5 分鐘用倒置相差顯微鏡檢查一次酶處理的進(jìn)度。特別難以分離的單分子層可置于 37°C 以促進(jìn)分散。酶溶液的預(yù)熱也會(huì)縮短暴露時(shí)間。為避免結(jié)塊，在等待細(xì)胞分離時(shí)不要通過敲打或搖動(dòng)燒瓶來攪動(dòng)細(xì)胞。

4.使用移液器將 6 至 8 mL 生長培養(yǎng)基添加到細(xì)胞懸浮液中，并從培養(yǎng)容器底部清洗所有剩余的細(xì)胞。此時(shí)，倒置顯微鏡的快速檢查應(yīng)顯示細(xì)胞懸浮液由至少 95% 的單細(xì)胞組成。5.如果不是這種情況，則可能需要更劇烈的移液。

6.收集細(xì)胞懸浮液，根據(jù)需要計(jì)數(shù)或分種接種物，然后分配到準(zhǔn)備好的培養(yǎng)容器中。對(duì)于某些細(xì)胞系和酶溶液（膠原酶），有必要在分配（接種）細(xì)胞之前通過溫和離心（125 × g 5 分鐘）去除酶。

計(jì)數(shù)細(xì)胞或分裂懸液

 為了確定生長速率或建立已知濃度的培養(yǎng)物，有必要對(duì)懸浮細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。可以使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器或電子細(xì)胞計(jì)數(shù)設(shè)備。血細(xì)胞計(jì)數(shù)器的優(yōu)點(diǎn)是價(jià)格較低，同時(shí)可以進(jìn)行存活率測定。

  輕輕混合細(xì)胞懸浮液并取出 0.5 mL 等分試樣進(jìn)行計(jì)數(shù)。向其中添加 0.5 mL 用于細(xì)胞計(jì)數(shù)的重要染色劑，例如臺(tái)盼藍(lán)或赤蘚紅 B?；旌暇鶆?，取出樣品，然后小心地裝入干凈的血細(xì)胞計(jì)數(shù)器。

    確定細(xì)胞懸浮液的實(shí)際濃度（細(xì)胞數(shù)/mL）和存活率百分比，并計(jì)算以適當(dāng)密度接種每個(gè)傳代培養(yǎng)物所需的懸浮液體積。懸浮液通常不計(jì)數(shù)細(xì)胞，而是分散在多個(gè)培養(yǎng)容器中。例如，1:2 拆分意味著將一個(gè)容器的細(xì)胞懸浮液分成兩個(gè)新容器，通常具有相同的表面積。這種方法適用于細(xì)胞系的日常維護(hù)，其中跟蹤準(zhǔn)確的細(xì)胞密度并不重要。 

平板培養(yǎng)

將細(xì)胞懸浮液的適當(dāng)?shù)确衷嚇臃峙涞綔?zhǔn)備好的容器中（將濃縮細(xì)胞懸浮液添加到空培養(yǎng)容器中會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞附著和生長不均勻）。生長較快的培養(yǎng)物通常在較低濃度下建立。除非最初添加min濃度的細(xì)胞，否則一些培養(yǎng)物不會(huì)生長良好。然而，大多數(shù)培養(yǎng)物在 10 3到 10 4 個(gè)細(xì)胞/cm 2或更高（7.5 × 10 4到 7.5 × 10 5個(gè)細(xì)胞/75-cm 2燒瓶）的初始濃度下會(huì)茁壯成長。 

重新培養(yǎng)培養(yǎng)物

將培養(yǎng)物放回振蕩培養(yǎng)箱中。大多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物在 35°C 至 37°C 之間的穩(wěn)定溫度下表現(xiàn)較好。除了保持恒定溫度外，用于培養(yǎng)皿和多孔板等未密封培養(yǎng)物的培養(yǎng)箱還必須保持高濕度和二氧化碳水平。高濕度減少了未密封培養(yǎng)容器中的蒸發(fā)損失，這會(huì)導(dǎo)致培養(yǎng)基變得高滲并對(duì)細(xì)胞造成壓力。如果與含有適量碳酸氫鹽的緩沖系統(tǒng)一起使用，升高的二氧化碳水平（通常為 5% 至 10%）有助于維持適當(dāng)?shù)?pH 值（7.0 至 7.6）。

   為了使這種類型的緩沖系統(tǒng)起作用，有必要使用未密封（松開的蓋子）或透氣的培養(yǎng)容器進(jìn)行氣體交換。如果沒有CO 2 ，緩沖系統(tǒng)可以在密閉容器中保持適當(dāng)?shù)?pH 值。

   第二天檢查培養(yǎng)物以確保細(xì)胞重新附著并活躍生長。根據(jù)需要更換介質(zhì)；對(duì)于大多數(shù)活躍生長的培養(yǎng)物來說，更換周期為約為每周 2 到 3 次。

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