大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備及質(zhì)粒轉(zhuǎn)化

一、實(shí)驗?zāi)康?/span>

    通過本實(shí)驗，掌握大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備及轉(zhuǎn)化的方法和技術(shù)。獲得感受態(tài)細(xì)胞；制備含有目的片段的陽性克隆。

二、實(shí)驗原理

轉(zhuǎn)化(Transformation)是將外源DNA分子引入受體細(xì)胞，使之獲得新的遺傳性狀的一種手段，它是微生物遺傳、分子遺傳、基因工程等研究領(lǐng)域的基本實(shí)驗技術(shù)。

轉(zhuǎn)化過程所用的受體細(xì)胞一般是限制修飾系統(tǒng)缺陷的變異株，即不含限制性內(nèi)切酶和甲基化酶的突變體(Rˉ，Mˉ)，它可以容忍外源DNA分子進(jìn)入體內(nèi)并穩(wěn)定地遺傳給后代。受體細(xì)胞經(jīng)過一些特殊方法(如電擊法，CaCl₂，RbCl (KCl) 等化學(xué)試劑法的處理后，細(xì)胞膜的通透性發(fā)生了暫時性的改變，成為能允許外源DNA分子進(jìn)入的感受態(tài)細(xì)胞 (Compenent cells)。進(jìn)入受體細(xì)胞的DNA分子通過復(fù)制，表達(dá)實(shí)現(xiàn)遺傳信息的轉(zhuǎn)移，使受體細(xì)胞出現(xiàn)新的遺傳性狀。將經(jīng)過轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞在篩選培養(yǎng)基中培養(yǎng)，即可篩選出轉(zhuǎn)化子(Transformant，即帶有異源DNA分子的受體細(xì)胞)。CaCl₂ 法簡便易行，且其轉(zhuǎn)化效率全可以滿足一般實(shí)驗的要求，制備出的感受態(tài)細(xì)胞暫時不用時，可加入占總體積15％的無菌甘油于-70℃保存(半年)，因此CaCl₂法使用更廣泛。

轉(zhuǎn)化率的計算：

統(tǒng)計培養(yǎng)皿中的轉(zhuǎn)化子數(shù)，轉(zhuǎn)化后在抗生素的平板上長出的菌落即為轉(zhuǎn)化子。

轉(zhuǎn)化子總數(shù)=菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)（轉(zhuǎn)化反應(yīng)原液總體積 / 涂板菌液體積）

轉(zhuǎn)化頻率（轉(zhuǎn)化子個數(shù)/每μg質(zhì)粒DNA）= 對照2轉(zhuǎn)化子總數(shù) / 質(zhì)粒DNA加入量（μg）

感受態(tài)細(xì)胞總數(shù)= 對照1菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)

感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率= 轉(zhuǎn)化子總數(shù) / 感受態(tài)細(xì)胞總數(shù)

為了提高轉(zhuǎn)化效率，實(shí)驗中要考慮以下幾個重要因素：

1. 細(xì)胞生長狀態(tài)和密度: 不要用經(jīng)過多次轉(zhuǎn)接或儲于４℃的培養(yǎng)菌，最好從-70℃或-20℃甘油保存的菌種中直接轉(zhuǎn)接用于制備感受態(tài)細(xì)胞的菌液。細(xì)胞生長密度以剛進(jìn)入對數(shù)生長期時為好，可通過監(jiān)測培養(yǎng)液的OD600 來控制。密度過高或不足均會影響轉(zhuǎn)化效率。

2. 質(zhì)粒的質(zhì)量和濃度: 用于轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒DNA應(yīng)主要是超螺旋態(tài)DNA(cccDNA)。轉(zhuǎn)化效率與外源DNA的濃度在一定范圍內(nèi)成正比，但當(dāng)加入的外源DNA的量過多或體積過大時，轉(zhuǎn)化效率就會降低。1ng的cccDNA即可使50μL的感受態(tài)細(xì)胞達(dá)到飽和。一般情況下，DNA溶液的體積不應(yīng)超過感受態(tài)細(xì)胞體積的5％。

3. 試劑的質(zhì)量: 所用的試劑，如CaCl₂ 等均需是最高純度的(GR.或AR.)，并用超純水配制，最好分裝保存于干燥的冷暗處。

4. 防止雜菌和雜DNA的污染：整個操作過程均應(yīng)在無菌條件下進(jìn)行，所用器皿，如離心管，tip頭等最好是新的，并經(jīng)高壓滅菌處理，所有的試劑都要滅菌，且注意防止被其它試劑、DNA酶或雜DNA所污染，否則均會影響轉(zhuǎn)化效率或雜DNA的轉(zhuǎn)入，為以后的篩選、鑒定帶來不必要的麻煩。

本實(shí)驗以E.coli TOP-10菌株為受體細(xì)胞，并用CaCl₂處理，使其處于感受態(tài)，然后與pUC質(zhì)粒共保溫，實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化。由于pUC質(zhì)粒帶有氨芐青霉素抗性基因 (Amp^r)，可通過Amp抗性來篩選轉(zhuǎn)化子。如受體細(xì)胞沒有轉(zhuǎn)入pUC，則在含Amp的培養(yǎng)基上不能生長。能在Amp培養(yǎng)基上生長的受體細(xì)胞（轉(zhuǎn)化子）已導(dǎo)入了pUC。

三、主要試劑

E.coli(Top-10, DH 5a)、CaCl₂、無菌水、胰蛋白胨、酵母粉、瓊脂、氨芐青霉素。

四、儀器耗材

控溫?fù)u床(37℃)、冷凍離心機(jī)（50mL轉(zhuǎn)子）、水浴鍋、冰箱（-20℃，-70℃）、超凈工作臺、培養(yǎng)箱(37℃)、分光光度計、移液器、槍頭、離心管、小三角瓶、6cm平皿、酒精燈、三角玻棒、酒精棉球、火柴

五、實(shí)驗步驟

感受態(tài)細(xì)胞制備：

1. 第一天：從大腸桿菌平板上挑取一個單菌落接于2 mL LB液體培養(yǎng)基的試管中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。

    2. 第二天：取0.5 mL菌液轉(zhuǎn)接到一個含有50 mL LB液體培養(yǎng)基錐形瓶中，37℃振蕩培養(yǎng)。2-3 h，測定OD600 ≤ 0.4-0.5，細(xì)胞數(shù)務(wù)必 ≤10⁸／mL。（此為實(shí)驗成功的關(guān)鍵)

3. 將菌液轉(zhuǎn)移到50 mL離心管中，冰上放置10 min。

4. 離心10 min，4000r/min，4℃，倒出培養(yǎng)液，將管倒置1min以便培養(yǎng)液流盡，回收細(xì)胞。

5. 用冰冷的0.1 mol/L CaCl₂ 10 mL懸浮沉淀，立即放在冰上30 min。

6. 4℃ 6000 r/min，離心10 min，回收細(xì)胞。

7. 用冰冷的0.1mol/L CaCl₂ 2 mL懸浮細(xì)胞，務(wù)必放在冰上。此細(xì)胞為感受態(tài)細(xì)胞。

8. 分裝，每管200 μL?？梢约尤?/span>15%甘油-70度保存。

轉(zhuǎn)化：

9. 取200 μL新鮮制備的感受態(tài)細(xì)胞，加入連接產(chǎn)物10μL（~50 ng ）混勻冰上放置30 min。

同時作2個對照管：

對照1：200 μL感受態(tài)細(xì)胞＋ 10μL無菌水（不含氨芐皿）每班做一個

對照2：200 μL 感受態(tài)細(xì)胞＋ 1μL 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒DNA溶液（10ng/μL）每班做1-3個

10. 將管放到42℃循環(huán)水浴90-120sec。

11. 冰浴2 min。（提前準(zhǔn)備好）

12. 每管加600 μL LB液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)1 h（慢搖）。

13. 將適當(dāng)體積已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞，離心后涂在含有氨芐青霉素的培養(yǎng)皿中。（提前倒好平板）

注意：對照1涂不加氨芐的平皿，菌液不離心，取1-10μL涂；

對照2涂氨芐平皿，菌液不離心，取5-20μL涂。

14. 倒置平皿37℃培養(yǎng)12-16 h，出現(xiàn)菌落。

15. 計算陽性對照的轉(zhuǎn)化頻率。

16. 記錄樣品的轉(zhuǎn)化子總數(shù)。

六、注意事項

1. 無菌操作。

2. 低溫操作。

3．注意加Amp時的溫度，溫度不能過高（55-60度），否則抗生素失活，會使克隆株無法篩選出來。

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