無論從事何種細(xì)胞培養(yǎng)，無菌技術(shù)都是絕對(duì)最重要的部分。細(xì)胞培養(yǎng)前的無菌處理技術(shù)分為三部分即：①工作環(huán)境及表面的處理；②細(xì)胞培養(yǎng)所用玻璃及塑料制品的處理；③實(shí)驗(yàn)者的操作技術(shù)；還有哺乳動(dòng)物細(xì)胞的處理及維持細(xì)胞生長(zhǎng)所需要的培養(yǎng)液的無菌處理。

1.工作環(huán)境的無菌處理

在細(xì)胞培養(yǎng)早期，研究者可以依靠操作技術(shù)和盡可能地靠近火焰以達(dá)到細(xì)胞的無菌化，隨著工作環(huán)境的機(jī)械學(xué)發(fā)展，其無菌化程度已得到大大提高，免去了實(shí)驗(yàn)者手指被燒灼的痛苦。層流超凈臺(tái)是使工作臺(tái)無菌化有效的手段，組織培養(yǎng)可在相對(duì)密閉而幾乎無對(duì)工作面外界氣流干擾的區(qū)域內(nèi)進(jìn)行。更周密(但較吊貴)的用于隔離無菌場(chǎng)所的設(shè)備就和用于手術(shù)間的設(shè)備相似，通過該場(chǎng)所的空氣均經(jīng)過HEPA過濾層后循環(huán)使用，通過出口處的氣流形式為向下和向外的。超凈臺(tái)的使用允許研究者將實(shí)驗(yàn) 室的一角轉(zhuǎn)變?yōu)榻M織培養(yǎng)區(qū)域，這種工作臺(tái)甚至在空氣經(jīng)過HEPA過濾的房間中也有其便利之處。空氣源污染主要是由于氣流和煙霧進(jìn)入培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)液污染所致，實(shí)際上保持無菌間足夠清潔而無污染物的堆積不太可能，而超凈臺(tái)即可提供容易清潔并可保持的良好工作臺(tái)。此外，超凈臺(tái)在研究者坐方對(duì)面的開放的前部形成一種向下的氣流屏障。

   超凈臺(tái)正常工作時(shí)，向下的氣流可阻擋外界空氣污染物進(jìn)入超凈臺(tái)。超凈臺(tái)HEPA過濾層應(yīng)在每年或一年后由被認(rèn)可的機(jī)構(gòu)進(jìn)行維修。購(gòu)買超凈臺(tái)時(shí)應(yīng)一同購(gòu)買內(nèi)部電源、真空泵和氣體的內(nèi)部出口。在某些情況下，研究者可在超凈臺(tái)中安裝空氣噴射裝置；超凈臺(tái)通常裝有紫外燈。水平氣流的超凈臺(tái)不宜使用，因?yàn)闅饬髦苯哟迪蜓芯空?，而可能?dǎo)致操作者無率的受到可能來白實(shí)驗(yàn)器材上的病原菌污染。同樣道理，從工作臺(tái)吹出的氣流在吹到周圍環(huán)境前也應(yīng)先通過隔離的HEPA過濾層蓄積，達(dá)到杜絕細(xì)菌和真菌繁殖的目的。工作臺(tái)內(nèi)只限放置每日工作所必湍的物品，其他非必需物應(yīng)去除。日常的清潔工作包括用70%乙醇或10%新潔爾滅擦洗工作臺(tái)，用一個(gè)連接到真空泵的密閉容器作為裝廢棄液的容器。該容器應(yīng)隨操作內(nèi)容改變后進(jìn)行高壓處理后再放入超凈臺(tái)內(nèi)：加入20ml新潔爾滅有助干防止微生物在其中的滋生繁殖，減少?gòu)U液的污染度、不要使用開放的燒杯或容器裝廢液，也不宜采用傾倒操作丟弁、廢棄的培養(yǎng)液，因?yàn)檫@操作都可導(dǎo)致廢液的氣霧化，從而能導(dǎo)致微小塵粒再次進(jìn)入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。

2.玻璃器具和塑料制品的無菌處理

  一次性用品。細(xì)胞培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿經(jīng)適當(dāng)處理后使細(xì)胞更易附著，通常單層細(xì)胞培養(yǎng)物在塑料瓶比玻璃瓶中更易附著、生長(zhǎng)更快。塑料瓶本身無活性，更適宜在4℃儲(chǔ)存溶液；而凍存管則宜使用玻璃制品，因?yàn)槠淇赡褪?/span>0℃以下低溫。

  盡管塑料吸管、瓶子比起玻璃器材有其優(yōu)點(diǎn)，但其價(jià)格昂貴.因?yàn)椴Ａе破房煞磸?fù)使用。但處理玻璃器材設(shè)備有限或沒有的實(shí)驗(yàn)室，選擇塑料制品更為合適。

   利用高壓滅菌器進(jìn)行組織培養(yǎng)器材的蒸氣滅菌是常用的滅菌方法。玻璃器材應(yīng)采用高壓滅菌后快速風(fēng)干法蒸發(fā)冷凝氣。瓶蓋應(yīng)松松地蓋在瓶口上進(jìn)行高壓滅菌，瓶子的消毒也可采取瓶口鋁箔包裹，瓶蓋單獨(dú)消毒的方法，待冷卻至室溫后在超凈臺(tái)中再蓋在瓶口上。玻璃吸管應(yīng)塞上棉花后再進(jìn)行滅菌，然后置烤箱中烘干以免棉塞殘留水份，應(yīng)遵照高壓滅菌器材生產(chǎn)廠家推薦的有效的高壓滅菌方法進(jìn)行操作。高壓滅菌法的效果取決于其蒸汽壓力和高熱狀態(tài)。許多溶液(如Tris緩沖液，細(xì)胞培養(yǎng)液)不應(yīng)采用高壓滅菌法進(jìn)行消毒，而用于微生物培養(yǎng)的培養(yǎng)液及多種鹽溶液宜采用“緩慢耗竭"及“濕 氣"循環(huán)法以防液體蒸發(fā)。不宜進(jìn)行高壓滅菌的瓶塞和其他用品可浸泡在70%乙醇中進(jìn)行消毒，并在超凈工作臺(tái)上吹干。

3.無菌操作

  無菌操作的原則就是保證細(xì)胞培養(yǎng)皿、培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)部以及吸管包裹層等內(nèi)部的無菌狀態(tài)。細(xì)胞培養(yǎng)需要比外科手術(shù)更加嚴(yán)格的無菌操作，因?yàn)殡x體細(xì)胞沒有免疫防御系統(tǒng)有幾種操作規(guī)程有助于無菌技術(shù)的掌握。細(xì)胞培養(yǎng)應(yīng)在超凈工作臺(tái)或有空氣濾過裝置的工作間里進(jìn)行；培養(yǎng)用液或其他溶液不應(yīng)在工作區(qū)以外打開，裝吸管的鐵筒同樣如此勿使用先前已打開的吸管簡(jiǎn)里的吸管。一旦筒蓋打開，盡量將筒內(nèi)吸管用完，如當(dāng)天尚未用完，應(yīng)從超凈工作臺(tái)內(nèi)取出，補(bǔ)充洗凈的吸管，然后重新進(jìn)行滅菌處理后備用。超凈臺(tái)在實(shí)驗(yàn)完畢后應(yīng)騰空，并用適當(dāng)?shù)南疽翰料醋烂妗?/p>

   對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)者來說，一次性乳膠手套的使用被視為一種安全的象征。但切記手套本身并不需要無菌。細(xì)胞培養(yǎng)中液體的吸取，均需機(jī)械移液裝置。采用口吸是最大的微生物污染源，更重要的是細(xì)胞培養(yǎng)液及成分通過食入或吸入方式進(jìn)入入體，可能對(duì)研究人員造成危害。

   細(xì)胞培養(yǎng)中用的各種瓶子僅在超凈工作臺(tái)中打開，瓶蓋應(yīng)蓋頂朝下放置于工作臺(tái)上，勿將瓶蓋放在非無茵工作區(qū)，如果瓶蓋的邊緣已污染，就可能通過與瓶口的接觸而污染瓶中的培養(yǎng)液或吸管、廢棄吸管、細(xì)胞培養(yǎng)瓶等應(yīng)放入可封裝的容器中，對(duì)可能含有潛在的生物有害物質(zhì)的物品應(yīng)采用焚燒和/或高壓火菌法進(jìn)行處理，這是一種大家廣為采用的安全措施。

    濕潤(rùn)的培養(yǎng)箱是常見的污染源。通常由充滿液體的托盤提供培養(yǎng)箱合適的度，而托盤本身即可導(dǎo)致各種細(xì)菌和真菌的污染，這種污染還存在于培養(yǎng)箱壁上和提供氣體的管道上。這些培養(yǎng)箱應(yīng)定期在細(xì)胞移至其他培養(yǎng)箱后進(jìn)行加熱處理(如果有加熱程序的話),或采用70%乙醇擦洗表面，并定期更換輸送C02的管 道。該管子可置于20%的含氯漂白劑中浸泡以達(dá)到消毒目的。采用高熱于燥法是一種相當(dāng)有效的消除細(xì)菌、真菌甚至真菌孢子的方法。C02培養(yǎng)箱中托盤始終用飽和濃度的磷酸氫二鈉(Na2HPO4)液體達(dá)到盤中的高鹽濃度，既使得細(xì)菌不能在其中生長(zhǎng)，而又能提供合適的濕度.每周均應(yīng) 補(bǔ)充無菌雙蒸水，而Na2HPO4應(yīng)在無固體鹽出現(xiàn)時(shí)加入。

   為了防止細(xì)胞系的交叉污染，超凈臺(tái)中應(yīng)只進(jìn)行一種細(xì)胞系的操作。較理想的方式是每種細(xì)胞系使用兩瓶各自單獨(dú)的培養(yǎng)液，以免一旦出現(xiàn)污染導(dǎo)致全部細(xì)胞的污染。這點(diǎn)對(duì)進(jìn)行克隆的衍生株或尚未凍存的新建立的細(xì)胞系特別重要。超凈工作臺(tái)中應(yīng)盡可能不放置任何設(shè)備和器材，以避免由于偶然接觸有菌物品導(dǎo)致的污染。在層流超凈臺(tái)中，允許培養(yǎng)液瓶口敞開，因?yàn)榭諝馐墙?jīng)過過濾后進(jìn)入工作臺(tái)的，所以進(jìn)入開口的瓶?jī)?nèi)的空氣是過濾的空氣。但是提倡在培養(yǎng)液不使用時(shí)將瓶口蓋緊，以免因?yàn)榕紶柵龅狡靠诨蚰梅欧菬o菌物品通過開放的瓶頸時(shí)使衣袖上或其他非無菌物品的細(xì)菌掉落到培養(yǎng)液中。培養(yǎng)箱中的細(xì)胞應(yīng)經(jīng)常置顯微鏡下觀察，每周至少兩次，以確定細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)或有無明顯的污染存在。不再需要的細(xì)胞應(yīng)該 立即丟棄，而不是繼續(xù)留在CO2培養(yǎng)箱中。

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