這篇不討論編輯效率怎么做高，只回答一個(gè)問(wèn)題：CRISPR-Cas9 RNP 與靶 DNA 的結(jié)合過(guò)程，怎么變成可讀的定量數(shù)據(jù)。文中所有數(shù)值均標(biāo)注了平臺(tái)與出處，便于逐條核對(duì)。

一、為什么這一步難量化：?jiǎn)栴}出在"解離太慢"

這套系統(tǒng)由蛋白與 sgRNA 組裝成核糖核蛋白復(fù)合物（RNP），靠 sgRNA 與靶鏈的 20 nt 堿基配對(duì)，加上非靶鏈上 PAM 序列與蛋白的識(shí)別作用完成定位。真正麻煩的地方在結(jié)合之后——

2016 年發(fā)表于 Nature Biotechnology 的研究用 BLI 在天然條件下測(cè)定了這一過(guò)程：將 5′ 生物素化的 55 bp 底物 DNA 固定在鏈霉親和素傳感器上，再分別讓切割型與催化失活的核酸酶（dCas9）結(jié)合。結(jié)果是：兩者對(duì) DNA 的親和力全相同（Kd 1.2 ± 0.1 nM），解離速率也相同（約 5.0 ± 0.3 ×10?? s?1），對(duì)應(yīng)復(fù)合物壽命 5.5 小時(shí)（論文摘要表述為約 6 小時(shí)）。同時(shí)，這一緊密結(jié)合依賴(lài) sgRNA 且必須有 PAM^[1]。

二、分子互作分析儀在這里給出哪些量

這里說(shuō)的分子互作分析儀，指的是基于生物膜干涉（BLI）原理的實(shí)時(shí)無(wú)標(biāo)記檢測(cè)平臺(tái)。它的原理是白光經(jīng)光纖射入傳感器前沿，在表面參考層與生物層外緣兩處反射產(chǎn)生干涉，分子結(jié)合使光學(xué)厚度增加、干涉光譜位移，儀器以 nm 位移隨時(shí)間實(shí)時(shí)記錄成結(jié)合曲線(xiàn)。整個(gè)過(guò)程不需要標(biāo)記、也不需要流路，傳感器直接浸入孔中讀數(shù)。

說(shuō)明：該方法屬群體平均測(cè)量，反映的是大量分子的整體行為；不同廠(chǎng)商平臺(tái)在靈敏度與分子量上存在差異，具體指標(biāo)以各平臺(tái)資料為準(zhǔn)。

三、三個(gè)可直接查證的數(shù)據(jù)錨點(diǎn)

錨點(diǎn) 1｜切割型與失活型核酸酶的親和力可以全相同

上一節(jié)引用的 Kd 1.2 nM 與 off-rate 5.0×10?? s?1 就是實(shí)測(cè)值。這一結(jié)果被后續(xù)研究廣泛引用，也解釋了為什么失活型（dCas9）適合做結(jié)合類(lèi)工具（如 CRISPRi）——它的結(jié)合能力與切割能力是兩件事^[1]。

錨點(diǎn) 2｜不同 CRISPR-Cas 效應(yīng)復(fù)合物，親和力可以差好幾個(gè)數(shù)量級(jí)

2020 年發(fā)表于 Frontiers in Molecular Biosciences 的工作系統(tǒng)展示了用 BLI 分析效應(yīng)復(fù)合物與靶標(biāo)結(jié)合的完整方法，并匯總了不同系統(tǒng)的親和力：Cas9（Type II）約 0.5 nM、Type V-A 達(dá) 54 fM、Type III-A 約 0.1 nM、Type I-F 約 1 nM、Type I-E 約 13 nM 或 20.7 nM^[2]。

該研究自身實(shí)測(cè)的兩個(gè) Type I 系統(tǒng)結(jié)果為：Type I-Fv Cascade（S. putrefaciens CN-32）KD 46.52 nM（R2 = 0.97），Type I-F Cascade（ S. baltica OS195）KD 99.57 nM（R2 = 0.98）。作者指出，這兩個(gè)值高于此前用 EMSA 報(bào)道的 P. aeruginosa Type I-F 系統(tǒng)的 1 nM，可能與 Cascade 組分差異有關(guān)^[2]。

錨點(diǎn) 3｜該技術(shù)也能用來(lái)篩"抑制核酸酶活性"的小分子

2019 年發(fā)表于 Cell 的工作建立了針對(duì) SpCas9 的高通量小分子抑制劑篩選平臺(tái)，其中實(shí)時(shí)無(wú)標(biāo)記檢測(cè)用于測(cè)定 DNA 與蛋白的互作，以及化合物與蛋白的結(jié)合。該實(shí)驗(yàn)在 96 孔板、180 μL 反應(yīng)體積中進(jìn)行，使用生物素化 dsDNA 與鏈霉親和素傳感器，并設(shè)置了 0、2、4、8 四種 PAM 密度^[3]。這說(shuō)明它在基因編輯領(lǐng)域的角色不止于"測(cè)親和力"，還可以進(jìn)入化合物篩選鏈路。

四、一次 RNP–DNA 的 BLI 實(shí)驗(yàn)怎么設(shè)計(jì)

下表把兩篇文獻(xiàn)的實(shí)驗(yàn)參數(shù)并列，便于對(duì)照取用。注意兩者固定對(duì)象不同：前者固定寡核苷酸（靶標(biāo) DNA），后者固定 dsDNA 并考察 PAM 密度。

五、六個(gè)容易踩的坑

"sgRNA 折疊影響 RNP"一項(xiàng)源自 Editas Medicine 在 CRISPR 50 Workshop 的會(huì)議報(bào)告，該報(bào)告用 BLI 通過(guò)響應(yīng)速率比較折疊與未折疊 gRNA 與 Cas9 的結(jié)合^[4]。該報(bào)告使用 Octet Red384 平臺(tái)，此處僅作方法學(xué)參考。

六、和其它方法怎么分工

該研究作者也建議，把該技術(shù)與 MST 等互補(bǔ)方法聯(lián)用，因?yàn)槿魏螁我黄脚_(tái)的精度都依賴(lài)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)^[2]。方法之間是分工關(guān)系，不是替代關(guān)系。

七、常見(jiàn)問(wèn)題（FAQ）

八、按通量選型：Gator 五個(gè)平臺(tái)怎么對(duì)號(hào)入座

把實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)落到具體機(jī)型時(shí)，最直接的判斷依據(jù)是候選數(shù)量與是否需要樣品溫控。下表為 Gator 平臺(tái)的公開(kāi)規(guī)格對(duì)照：

結(jié)合實(shí)際場(chǎng)景：幾十個(gè)變體做親和力排序，Prime 或 Plus 的 8 通道并行已能覆蓋；數(shù)百個(gè)候選（如 anti-CRISPR 突變體庫(kù)、小分子抑制劑初篩），Plus 的 456 樣本/批或 Pro 的 1152 樣本量級(jí)更順；樣品本身不穩(wěn)定，則優(yōu)先考慮帶樣品溫控的 Plus+（10–40℃）與 Pivot（15–40℃）。

以上規(guī)格引自產(chǎn)品資料，采購(gòu)前請(qǐng)以清單單為準(zhǔn)；如需具體型號(hào)對(duì)比與來(lái)樣測(cè)試方案，可參考 小鱷生物品牌頁(yè)，或直接聯(lián)系下方電話(huà)。

九、配套儀器與耗材

圍繞這類(lèi)實(shí)驗(yàn)，除 小鱷生物系列分子互作分析儀外，上游樣品與耗材同樣影響數(shù)據(jù)穩(wěn)定性：

• 儀器選型：低通量驗(yàn)證可選 Pilot（4 通道）；常規(guī)動(dòng)力學(xué)與篩選可用  Plus（8 通道）；大規(guī)模變體或表位圖譜可看 Pro（32 通道），Prime 與 Pivot 的規(guī)格見(jiàn) 品牌頁(yè)。

• 質(zhì)粒與模板制備：sgRNA 模板與表達(dá)質(zhì)粒的純度會(huì)直接影響 RNP 組裝一致性，可參考 天根 DP103 質(zhì)粒小提試劑盒。

• 微量加樣：96/384 孔板的加樣一致性影響基線(xiàn)噪聲，可搭配 瑞寧 E4 XLS+ 多道電動(dòng)移液器。

• 樣品與蛋白保存：RNP 與純化蛋白建議低溫分裝保存，可參考 海爾 -86℃ 超低溫冰箱。

• 編輯效率交叉驗(yàn)證：結(jié)合類(lèi)數(shù)據(jù)之外，編輯效率通常需另一套方法佐證，可參考 朗基 Q2000B 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 儀。

延伸閱讀（本站）：從 SPR 到 BLI：Gator 非標(biāo)記分子互作儀在抗體藥 5 大核心環(huán)節(jié)的技術(shù)優(yōu)勢(shì)解析　· Gator BLI 分子互作儀 5 大應(yīng)用場(chǎng)景解析　· 分子互作分析儀類(lèi)目