組氨酸標(biāo)簽蛋白分離層析親和純化介質(zhì) Ni NTA Beads 產(chǎn)品信息

Ni NTA Beads是以4%瓊脂糖凝膠為基質(zhì)，通過(guò)化學(xué)方法偶聯(lián)了四配位的氮川三乙酸（ NTA），螯合鎳離子（ Ni2+）后，可以形成非常穩(wěn)定的八面體結(jié)構(gòu)，鎳離子處于八面體的中心，這樣的結(jié)構(gòu)很有效的保護(hù)了鎳離子免受小分子的進(jìn)攻，更加穩(wěn)定。 Ni NTA Beads可以耐受一定濃度的還原劑、變性劑.

組氨酸標(biāo)簽蛋白分離層析親和純化介質(zhì) Ni NTA Beads    產(chǎn)品性能

2.純化流程

2.1緩沖液的準(zhǔn)備

可使用下列拋李緩沖液，也可根據(jù)自己的使用習(xí)慣配置不同的緩沖液體系，基本原理就是低咪唑上樣，高咪唑洗脫，或者高 pH上樣，低pH洗脫。緩沖液在使用前最好用0.22 pm 載者0.45 μm 濾膜過(guò)濾。因?yàn)镹INTA Beads可以用于可溶蛋白和包涵體蛋白的純化，兩種方法所需緩沖液不同。具體配置方法見(jiàn)表3、表4和表5。

2.2樣品準(zhǔn)備

2.2.1細(xì)菌或酵母表達(dá)的蛋白

1）挑取單茵落到培養(yǎng)基中，根據(jù)載體使用說(shuō)明，加入相應(yīng)濃度的誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)相應(yīng)的時(shí)間。

2）表達(dá)結(jié)束后，將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移到離心杯中，7，000 pm（7，500xg），離心 15 min收集菌體，然后按照菌體；Lysis Buffer=1∶10（W//）加

入Lysls Buffer，加入終濃度為1 mM的PMSF。加入溶菌酶（工作濃度為0.2-0.4 mg/ml，如果表達(dá)的宿主細(xì)胞內(nèi)含 pLysS 或 pLysE，可以不加溶菌酶），（同時(shí)也可加入其他蛋白酶抑制劑，但不能影響目的蛋白與樹(shù)脂的結(jié)合）。

3）將菌體沉淀懸浮起來(lái)，（如果菌液濃度高，也可考慮加入10 μg/ml RNaseA和5ug/mlDNase I），濕勻，放置于冰上，然后冰上超聲破碎細(xì)胞，至菌液基本保持澄清。

4）將澄清的破碎液轉(zhuǎn)移至離心管中，10，000 rpm（15，000xg），4℃離心20-30 min。取上清，置于冰上備用或-20℃保存。

2.2.2 酵母、昆蟲(chóng)和哺乳細(xì)胞分泌表達(dá)可溶性蛋白

1）將細(xì)胞培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至高心杯，5，000 pm（3，800xg），離心10 min，收集菌體得上清，如上清中不含EDTA、組氨酸和還原劑等物質(zhì)，即可直接加入柱子使用；如含有EDTA、組氨酸和還原劑等物質(zhì)，需用Lysis Buffer透析才能加入柱子。

2）對(duì)于大量體積的上清，需加入硫酸銨沉淀濃縮后，蛋白還需用Lysis Buffer透析后才能加入柱子。

2.2.3包涵體蛋白純化（變性條件）

1）將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移到離心杯中，7，000 rpm（7，500xg），離心15min收集菌體，去掉上清。

2）按照菌體∶Lysis buffer（不含8M尿素）=1∶10（W/）將菌體懸浮起來(lái)混勻，冰浴超聲破碎。

3）將破碎液轉(zhuǎn)移至離心管中，10，000 rpm（15，000×g），4℃離心20-30min。去掉上清，步驟2和3可以重復(fù)一次。4）按照菌體∶Lysis buffer（含8M尿素）=1∶10（W/V）將包涵體懸浮起來(lái)。5）變性條件下進(jìn)行His標(biāo)簽蛋白純化，具體緩沖液配方見(jiàn)表4、表5。2.3NiNTABeads重力柱的裝填

1）取合適規(guī)格的重力層析柱，裝入下墊片，加入適量純水潤(rùn)洗柱管和墊片，關(guān)閉下出口。

2）將NiNTABeads混合均勻，用槍頭吸取適量漿液加入至重力柱中（介質(zhì)實(shí)際體積占懸液的一半），打開(kāi)下出口流干保護(hù)液。3）加入適量純水沖洗介質(zhì)，待柱管中液體重力流干后，關(guān)閉下出口。

4）裝入潤(rùn)洗后的上墊片，確保墊片與填料之前沒(méi)有空隙，且保持水平。

5）裝填好的重力柱可以直接加入平衡液進(jìn)行平衡，暫不使用時(shí)則加入保護(hù)液，4-30℃保存。

2.4樣品純化流程

2.4.1 孵育法純化

1）根據(jù)純化的樣品量，取適量Ni NTA Beads加入離心管中，1000 rpm離心1min，吸棄上清；也可加入重力柱中，流干保護(hù)液。

2）向離心管中加入5倍介質(zhì)體積的LysleBuffer清洗介質(zhì)，1000 rpm 離心1min，吸棄上清如使用重力柱，則直接在重力柱中清洗，直接重力流干Lysis Buffer重復(fù)兩次以上。

3）加入樣品，封閉離心管或重力柱管，4℃振蕩孵育2-4h或者37℃孵育30min-2h。

4） 孵育結(jié)束后，1000 rpm離心1min，吸棄上清，或過(guò)濾收集介質(zhì)，上清保留作為流穿，用于電泳鑒定。

5）用5倍介質(zhì)體積的WashBuffer清洗介質(zhì)，1000rpm 離心1min 或重力柱管過(guò)濾，去除上清（注意不要吸到介質(zhì)），重復(fù)3-5次，中間建議更換新離心管。必要時(shí)可以調(diào)整咪唑的濃度進(jìn)行洗雜。

6）加入3-5倍柱體積的Eltton Buffer進(jìn)行洗脫，寬溫孵育10-15min，1000 rpm高心1mln或重力柱管收集洗脫液，可重復(fù)2-3次；

2.4.2重力柱法純化

1）將裝填好的NINTABeads重力柱用5倍柱體積LyslsBuffer進(jìn)行平衡，使填料處于與目的蛋白相同的緩沖液體系下，重復(fù)2-3次。

2）將樣品加到平衡好的重力柱中，樣品保留時(shí)間至少2 min;保證樣品和介質(zhì)充分接觸，收集流出液，可以反復(fù)上樣增加結(jié)合效率。3）用 10-15 倍柱體積的Wash Buffer 進(jìn)行洗雜、夫除非特導(dǎo)性吸附的雜蛋白，收集洗雜液。必要時(shí)可以調(diào)整咪唑的木度進(jìn)行洗先雜。

4）使用5-10倍柱體積的 Elution Buffer 洗脫，分段收集，每一個(gè)柱體積收集一管，分別檢測(cè)，既可以保證所有結(jié)合的目的蛋白被洗脫，又

可以得到高純度和高濃度的蛋白。

上述步驟介質(zhì)洗尚結(jié)束后，先用Lysis Buffer 沖洗3 倍柱體積.然后用純水沖洗5倍柱體積，再用 20%乙醇沖洗2個(gè)柱體積，然后將介質(zhì)置于2-8℃保存。2.5 SDSPAGE 檢測(cè)

將使用純化產(chǎn)品得到的樣品（包括流出組分、洗雜組分和洗脫組分）以及原始樣品使用 SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)化效果。

3.在位清洗

當(dāng)填料使用過(guò)程中發(fā)現(xiàn)反壓過(guò)高或者填料上面出現(xiàn)明顯的污染時(shí)，需要進(jìn)行在位清洗操作（Cleaning-in-Place，CIP）。建議按照下面操作去除填料上殘留的污染物，如沉淀蛋白、疏水蛋白和脂蛋白等。去除強(qiáng)疏水結(jié)合的蛋白，脂蛋白和脂類

通過(guò)使用 30%異丙醇清洗 5-10個(gè)柱體積，接觸時(shí)間為 15-20 min 可以去除此類污染物。然后，再使用 10倍柱體積的去離子水清洗。也可以選擇使用含有去污劑的酸性或堿性溶液，清洗填料2倍柱體積。例如，含有0.1-0.5%非離子去污劑的0.1M醋酸溶液，接觸時(shí)間為 1-2 h。去污劑處理后，需要使用 70%的乙醇清洗5個(gè)柱體積，以*去除去污劑。最后使用 10倍柱體積的去離子水清洗。去除離子作用結(jié)合的蛋白

使用 1.5 M NaCI溶液清洗 10-15 min。然后，再使用去離子水清洗 10個(gè)柱體積。

4.填料再生

組氨酸標(biāo)簽蛋白親和純化填料所帶的鎳離子不需要經(jīng)常螯合去除和重新掛鎳離子。當(dāng)填料使用過(guò)程中發(fā)現(xiàn)顏色變淺，或者填料載量明顯變低時(shí)，需要進(jìn)行對(duì)填料進(jìn)行簇離子剝離和重新掛鎳離子，也就是填料再牛。將填料裝填在合適的層柱內(nèi)，按照下面操作流程進(jìn)行鎳離子剝離和重新掛鎳離子。

1）使用5倍柱體積去離子水清洗填料;

2）使用5倍柱體積100 mM EDTA（pH 8.0）剝落鎳離子;

3）使用 10倍柱體積去離子水清洗填料;

4）使用0.5 M NaOH清洗5倍柱體積，停留 10-15 min;

5）使用去離子水清洗填料，直至 pH中性;

6）使用3-5倍柱體積 100mM NiSO4再生掛鎳;

7）使用10倍柱體積去離子水清洗;

填料再生后，可以立即使用，如不立即使用，需要將填料懸浮于等體積的 20%乙醇中，置于4-30°℃保存。

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